取同批号待检法兰克福香肠6~7袋,单核搓揉外包装,细胞性单使内容物与液体充分接触。增生珠的制备无菌开启包装,李斯链抗取浸出液40mL(每袋约6mL),特菌特异体磁混匀,单核作为待测样,细胞性单置4℃保存。增生珠的制备人工污染前,李斯链抗取1mL浸出液通过增菌培养法检测待测样。特菌特异体磁选择未受李斯特菌属污染的单核待测样,接种新鲜培养的细胞性单单核细胞增生李斯特菌(ATCC19115),使其终浓度约为<1CFU/mL、增生珠的制备1CFU/mL、李斯链抗10CFU/mL和100CFU/mL。特菌特异体磁污染后将样品置4℃稳定24h,模拟食用前的微生物存活状态。
取40mL待测样,分别接种新鲜培养的单核细胞增生李斯特菌ATCC19115(LM)和英诺克李斯特菌ATCC51742(LI)。菌液终浓度LM/LI的比例分别为1/1,1/10,1/100,1/1000,10/10,10/100,10/1000,100/10,100/100和100/1000。污染后将样品置4℃稳定24h。
分别将3株单核细胞增生李斯特菌和6株其它李斯特菌属细菌接种至BHI培养基中培养(表3),制成约105CFU/mL菌液。取上述菌液1mL,分别加入20μL免疫磁珠溶液,4℃轻微振荡1h。用PBS缓冲液在磁力架上清洗3次,用1mL相同的缓冲液重悬,必要时进行10倍系列稀释。以6×6滴板计数法(每滴10μL)在BHI琼脂培养基上计数,比较磁珠捕获前后微生物的数量变化。
以USDA-FSIS检测方法为基础(MicrobiologyLaboratoryGuidebook,MLG8.1),结合磁珠捕获和PCR确认技术,检测法兰克福香肠中的单核细胞增生李斯特菌。取第1次增菌的UVM培养基(Modifieduniversityofvermontbroth)90mL,加入10mL人工污染浸出液,置(30±2)℃振荡160r/min培养(22±2)h。分别取0.1mLUVM培养物至第2次增菌的10mLFB培养基(Fraserbroth)和10mLMOPS-BLEB培养基(Morpholinepropanesulfonicacidbufferedlisteriaenrichmentbroth)中,置(35±2)℃振荡250r/min培养(26±2)h。取上述UVM、FB和MOPS-BLEB培养物各1mL,分别加入scFv-IMBs和Dyna-IMBs溶液20μL,按1.6.1节的方法分别在BHI琼脂和显色琼脂上计数。剩余的磁珠捕获液用于显色培养基划线和细菌基因组DNA提取。
采用9株细菌考察BHI培养基中两种磁珠的特异性。scFv-IMBs对3株单核细胞增生李斯特菌的捕获率在15%~55%之间,高于同种培养基中Dyna-IMBs的0.85%~1.27%捕获率。scFvIMBs除对斯氏李斯特菌和伊氏李斯特菌的捕获率略高于Dyna-IMBs外,对李斯特菌属中非单核细胞增生李斯特菌的捕获率均低于0.61%。在BHI纯培养系统中,scFv-IMBs显示出良好的特异性和较高的捕获率。
为了从5种备选的引物中选择出单核细胞增生李斯特菌特异性PCR检测引物,针对23株待测微生物进行PCR引物验证。引物Lmo0733具有李斯特菌属水平特异性;格式李斯特菌干扰引物Aznar的检测;威尔斯李斯特菌、格式李斯特菌和部分英诺克李斯特菌干扰引物Jaton的检测。经试验确认的单核细胞增生李斯特菌种水平的特异性为引物Fluit和Nied(表1),这两对引物目标靶点是对李斯特菌溶血素O基因(hlyA)。由于引物Nied在51℃退火时具有较高的检测灵敏度,可检测到约2.86pg的单核细胞增生李斯特菌基因组(数据未列出),被用于后续试验的PCR检测中。
在BHI和显色培养基上计数的菌落数(或典型菌落数)分别代表了样品经UVM、FB或MOPS-BLEB培养基培养后,所有微生物的总数和单核细胞增生李斯特菌的数量。法兰克福香肠浸出液经增菌培养后,背景菌的浓度可达到107~108CFU/mL,而单核细胞增生李斯特菌的浓度约为102~104CFU/mL,背景菌在培养物中占据主导地位(表4)。由于高浓度背景微生物影响磁珠与目标微生物的结合,导致在第一步UVM培养基中两种磁珠的捕获率均低于5%,甚至无法在琼脂平板上分离获得目标菌。经FB和MOPS-BLEB培养基二次增菌后,单核细胞增生李斯特菌的比例由第1次增菌前不足0.01%(浓度小于104CFU/mL)迅速提升到20%~80%(浓度约为106~108CFU/mL),而背景菌的数量未见显著增加(表4)。其中,经MOPS-BLEB培养后李斯特菌属细菌的终浓度会高于FB培养基,并成为体系内优势菌,具有较好的选择培养性。
采用scFv-IMBs和Dyna-IMBs两种磁珠捕获后,通过显色培养基和PCR检测证实,磁珠捕获方法对单核细胞增生李斯特菌的灵敏度可达1CFU/mL。两种磁珠在MOPS-BLEB培养基中的捕获率(62%~88%)明显高于UVM培养基(<5%)和FB培养基(<53%)中的捕获率。
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